معرفة التسلسل النووي(DNA sequencing )
لا شك أن العلماء يحتاجون إلى معرفة التركيبة التسلسلية لكل جين و هذا يمكنهم من معرفة المزيد عن البروتين الذي يصنعه ذلك الجين وعن التركيبة التنظيمية لعمل الجين و قد يصلون على ضوءه إلى معرفة الأمور التي
تتحكم في عمله.كما انه بمعرفة التسلسل النووي للجين يمكن مقارنته بالجينات التي سبق اكتشافها و هذا قد يعطي معلومات غزيرة عن وضيفة هذا الجين و يختصر الكثير من الابحاث
تتحكم في عمله.كما انه بمعرفة التسلسل النووي للجين يمكن مقارنته بالجينات التي سبق اكتشافها و هذا قد يعطي معلومات غزيرة عن وضيفة هذا الجين و يختصر الكثير من الابحاث
و يتجنب اعادة اجرائها.وهناك طريقتان أساسيتان لمعرفة التسلسل النووي لأي قطعة من الدي إن أي.الأولى تسمى بالطريقة الإنزيمية (Enzymatic method ) و الأخرى بالطريقة الكيميائية(Chemical ).و لقد طغت الطريقة الأولى حتى أصبحت هي الطريقة الأكثر استعمالا.
الطريقة الإنزيمية (Enzymatic method ):
يطلق على هذه الطريقة أيضا طريقة سنجر (Sanger procedure )نسبة إلى د.فريدريك سنجر و الذي أسس هذه الطريقة.كما أنها أيضا تعرف التسلسل عن طريق دي ديوكسي (dideoxy sequencing).و تترتكز هذه الطريقة على مفهوم أن شريط الدي إن أي في الأساس مبنى من جزيئات من الديوكس
يطلق على هذه الطريقة أيضا طريقة سنجر (Sanger procedure )نسبة إلى د.فريدريك سنجر و الذي أسس هذه الطريقة.كما أنها أيضا تعرف التسلسل عن طريق دي ديوكسي (dideoxy sequencing).و تترتكز هذه الطريقة على مفهوم أن شريط الدي إن أي في الأساس مبنى من جزيئات من الديوكس
يختلف الديوكسي نيوكلويتيد عن دي ديوكسي بيوكلوتيد بعدم و جود مجموعة (هيدروكسي)في النقطة الثالثة من حلقة السكر الخماسية الشكل.
نيوكلويتيد (deoxynucleotides (dNTPs )و يوجد على النقطة الثالثة من حلقة السكر الريبوزي مجموعة مؤكسدة أي مجموعة هيدروكسيه( OH)و هذه النقطة هي التي ترتبط في النقطة الخامسة من الجزيء الذي يليها و هكذا يتم الترابط لتكوّن شريط طويل من الدي إن أي.و لقد قام د.ستنجر بالاستفادة من هذه الخاصية فبدّل الجزيء من (OH)إلى (H ) عن طريق إضافة دي ديوكسيو بيوكلوتيد(ddNTPs) بدل من ديوكسي نيوكلوتيد(dNTPs ) و ذلك عن طريق نسخ الشريط مرة أخرى و هذا يؤدي الى توقف ترابط الجزيئات و يكون في طرف كل جزيء نوع واحد من الأحماض النووية.
و إليك الخطوات الأساسية للقيام بهذا الاختبار بالترتيب:
1- القيام بنسخ الدي ان أي و ذلك على الشكل التالي:
أ- أضف إلى عينة الدي إن أي قطع من البريمر(specific primer)يعرف انه سوف يلتصق بالدي إن أي المراد نسخة و معرّف(ملتصق بطرفة) بعنصر مشع.
ب- قسم العينة إلى أربع أنابيب اختبار و كل أنبوبة اكتب عليها السماء التالية (dGTP, dATP, dCTP, and dTTP)..
ج- أضف إنزيم البولمريز ( DNA polymerase)
د-أضف إلى كل أنبوبة نوع واحد من الدي ديوكسي نيوكليتيد حسب اسم الأنبوب.و أضيف معه كمية من ديوكسي نيولكليتيد.سوف يحدث التفاعل و يبداء البريمر ببنان و تركيب و رص هذه الأحماض النووية.وعند إضافته لدي ديوكسي نيوكليتيد فان الشريط يتوقف على هذه النقطة.ثم يحدث تفاعل أخر لنسخ شريط أخر و عند إضافة دي ديوكسي نيوكليتيد يتوقف التفاعل و هكذا تستمر العملية و ينتج عندي في النهاية قطع منسوخة و متفاوتة الطول في كل أنبوب اختبار.
2- أضيف كمية من كل الأربعة أنابيب في حقل خاص على لوح الاقروز ثم امرر تيار كهربائي و من ثم تظهر على طول اللوح القطع المنسوخة و المتفاوتة الأطوال كل حقل يعطيني ترتيب القطع.
3-تعريضها للأشعة(Autoradiography) لكي يتسنى رؤية الدي إن أي و الذي عليه مادة مشعة.
4- ابدأ بقراءة لوح الاقروز من أسفل إلى أعلى.وكل ما مر على نسخة من الدي إن أي اعرف ترتيب و نوع الديديوكسي نيوكليتيد الذي في طرفة و استمر في القراءة إلى أن ينتهي لوح الاقروز.
و لتسهيل عملية القراءة استخدم الكمبيوتر لكي يقرأها بشكل إلي و ذلك بتعريض لوح الاقروز إلى أشعة ليزر و عن طريق وحدة استشعار و مضخم للنبضات (photomultiplier ) يستطيع الكمبيوتر أن يحدد نوع الدي ديوكسي نيوكليتيد و ثم يرتبها و يطبعها و يعطيك رسماً بيانياً لاماكن كل حمض نووي و بالألوان.و لا تستخدم المواد المشعة في القراءة الآلية بالكمبيوتر بل يستعاض عنها بمادة مضيئة(fluorescent ) توضع على البريمر على أن يكون لكل دي ديوكسي نيوكليتيد لون مختلف عن الآخر(أي أربعة ألوان من المادة المضيئة) و بذلك يمكن أن تمر جميع القطع في ممر واحد كما هو واضح في الرسم الجانبي. و نظرا إلى أن جهاز الكمبيوتر قابل للخطاء فانه يلزم التدقيق و المراجعة لتفادي حدوث الأخطاء.و لقد قامة أجهزة كمبيوتر عملاقة تعمل على مدار الساعة و تحت مظلة مشروع الجينوم البشري بالكشف الكامل(99% تقريباً)من التسلسل النووي لجميع الدي إن أي الموجود في الإنسان و قد سبق ذلك الكشف عن التسلسل النووي لكثير من الكائنات الحية و العمل جاري لمعرفة المزيد.
الناقلات ( Vectors)
الناقل و التي تسمى باللغة الإنجليزية "فيكتور" هي في الغالب فيروسات أو قطع من الحمض النووي موجودة في البكتيريا.كما أن هناك أنواع صناعية تم صنعها في المختبرات الطبية و هي في العادة مواد شبه صناعية لأنها في الأصل مصنعة من مواد موجودة في الطبيعة.و من لديهم اهتمام بالبروتكولات و الطرق التعامل مع هذه الناقلات اقترح عليك مراجعة هذه الصفحة ولاتي تحتوي على العديد من الروابط المتعلقة بالعناية بالناقلات ( اضغط هنا )
البلازميد ( Plasmid )
و هي من اشهر الناقلات ،و هو عبارة عن قطعة صغيرة من الحمض النووي قابلة للتكاثر بمعزل عن بقية الحمض النووي الموجود في الكروموسومات .و هي شبيهة بالفيروس الصغير و لكنها لا تحتوي على طبقة خارجية من البروتين.
و هي من اشهر الناقلات ،و هو عبارة عن قطعة صغيرة من الحمض النووي قابلة للتكاثر بمعزل عن بقية الحمض النووي الموجود في الكروموسومات .و هي شبيهة بالفيروس الصغير و لكنها لا تحتوي على طبقة خارجية من البروتين.
. و البلازميد عبارة عن قطعة من الحمض النووي موجود في البكتيريا خاصة في الاي كولي(E.Coli) و بعض أنوع الخميرة ( Yeast) .و لدية القدرة على التكاثر الذاتي و بمعزل من بقية الكروموسومات
الموجودة في الخلية.كما أن هناك بلازميدات تستطيع التكاثر داخل البكتيريا و الخميرة في آن واحد. و يوجد نوعان من البلازميد على حسب نوع الحمض النووي فيها فهناك البلازميد المصنوع من الدي إن أي (DNA ) و نوع أخر مصنوع من الأر إن أي (RNA ). و هناك أنواع عديدة من البلازميد فمنها الصغير و منها الكبير كما أن منها ما لا يحتوي على أي جين بينما هناك أنواع كبيرة تحتوي على عدة جينات.و بالإضافة إلى وحدة التكاثر الذاتي الموجد على البلازميد هناك الكثير من الجينات التي قد تكون على البلازميد و هي مفيدة للعلماء في عملية نسخ الجينات و القطع النووية فمثلا فد يوجد على البلازميد جين خاص يكافح المضادات الحيوية كالمبيسيلين و التترسيكلين .و هذه الجينات الحامية من المضادات الحيوية تساعد في التعرف و عزل البكتيريا التي تحتوي على البلازميد الذي عليه الجين الذي كنا ننوي استنساخه (للمزيد راجع عملية نسخ الجينات و القطع النووية)و يعتقد نظريا أن الفيروسات المنتشرة في الأصل كانت بلازميدات حيث أنها اكتسبت غلاف بروتيني خارجي و أصبحت فيروساً.
أنواع البلازميد التي تنمو في خميرة الخبز
YIP, yeast integrating plasmid = selectable marker +cloning sites
YRP, yeast replicating plasmid = YIP + ARS origin of replication
YEP, yeast expression plasmid = YIP + 2 micron origin of replication
YCP, yeast centromere plasmid = YRP + centromere sequence
الناقلات الفيروسية ( Viral Vectors) :
إن اشهر هذه الأنواع هي الفيروسات البكتيرية المعروفة بالفيج ( Phage). و هي عبارة عن قطعة من الدي ان أي مغطاة بغلاف بروتيني. ومن اشهر أنواع الفيج ما يسمى بفيج لمدا (lambda phage) و هو فيروس موجود في الاي كولي E. coli. وهذا النوع من الناقلات تستطيع أن تحمل قطعة من الدي إن أي حتى غاية كيلوبيز.و لقد حوّرت هذه الفيروسات لكي تستطيع حمل كمية اكبر من الدي إن أي.فعلا سبيل المثال الكوزميد ( Cosmids ) عبارة عن تهجين جزء(قطعة من الدي ان تسمى اللاصقة cohesive sequence و تعرف مختصرة بالكوز Cos sequence) من فيج ليمبدا(Phage ) مع بلازميد (Plasmid ) و الذي يستطيع نقل حتى 40 كيلوبيز (40kb ) و الباك الفيروسي المسمى بكروموسوم بي 1 الصناعي (PAC P1-derived Artificial Chromosomes / ) عبارة عن تحوير للفيج بي 1 (P1 Bacteriophage ) و إضافته إلى البلازميد..
Cos sequence from Lambda phage + Plasmid
P1 Phage + Plasmid
Modified E.coli fertility plasmid-factor
الناقلات الكروموسومية الصناعية (Artificial Chromosomes ):
نظرا للحاجة إلى نقل إحجام كبيرة من الدي إن أي فقد قام بعض العلماء بتحوير بعض الناقلات الطبيعية لكي تقوم بهذه المهمة.و يوجد حاليا ناقلات على شكل كروموسوم و فيها القطع الأساسية لكي تعمل على شكل كروموسوم.و من هذه الأنواع ما يعرف بــ الياك او كروموسوم الخميرة الصناعي(Yeast Artificial Chromosomes / YAC ) و الذي يستطيع نقل أكثر من 500 كيلوبيز (500 kb ).و الياك عبارة عن قطعة من الدي ان أي مترابطة و تحتوي على طرفين للكروموسوم(2 Telomeres) و مركز للكروموسوم(Centromere) و مركز للتكاثر(Autonomous replicating sequence ARS).بينما الباك البكتيري(Bacterial Artificial Chromosomes / BAC )و الذي يستطيع حمل حتى 150 كيلوبيز (150 kb ) هو تحوير للبلازميد المعروف ببلازميد تناسل بكتيريا الايكولي(E.coli fertility plasmid-factor)).
نوع الناقل
Vector
حجم الدي ان أي الذي يستطيع حملة
البلازميد Standard plasmid
0- 10 KB
Lambda Bacteriophage
0-23 Kb
Cosmid
30-44 Kb
Bacteriophage P1
70-100 Kb
P1Artificial chromosome PAC
130- Kb 150
Bacterial Artificial Chromosome BAC
بحد أقصى 300 Kb
كروموسوم الخميرة الصناعي Yeast Artificial Chromosome YAC
المرجع:1996Human Molecular Genetics by T.Strachan and A.Read
النسخ والاستنساخ(Cloning): يشتهر بين الناس كلمة الاستنساخ نظرا لارتباطها بخلق الكائنات أو إنشاء نُسخ منها.و لكن بالمصطلح الطبي فان كلمة نسخ أو استنساخ تعنى عملية إنشاء صورة طبقا الأصل من المادة التي يراد نسخها.و قد يكون النسخ لقطعة من الدي إن أي أو نسخ كائن حي متكامل.و لا شك أن لغتنا العربية تفرق بين كلمة نسخ و استنساخ و لكننا سوف نستخدم كلمة نسخ أو استنساخ في حديثنا لنعني نفس الشيء. و في كلمة استنساخ باللغة العربية تعني ( Cloning)وينتج عنه نسخة أو مستنسخ (Clone).
عندما قام الدكتور... و فريقه العلمي بنشر (Nature 385, 810-13, 1997 )خبر استنساخ النعجة "دولي" في احد مختبرات اسكتلندا ( مختبر روزيلين ) عام 1997 زاد اهتمام العالم بموضوع الاستنساخ و زاد الفضول العلمي في الحديث عن استنساخ الإنسان و فجر ذلك الخبر الكثير من التحفظات الدولية من كثير من المراكز الدينية و العلمية على الجانب الأخلاقي من عملية استنساخ الإنسان.
و بعد ذلك اخبر أصبحت كلمة استنساخ تستخدم بين العامة في الحديث عن عملية خلق نسخة أخرى من الحيوان أو الإنسان و بذلك بدأ البس بين الكثيرين في معنى هذه الكلمة.و لا شك فان العلماء كانوا و مازالوا يستعملون هذه الكلمة في الإشارة إلى عملية صنع نسخة من أي مادة وراثية و ليس بالضرورة خلق أو نسخ كائن حي بالكامل. و لذلك فالعلماء يقسمون الاستنساخ أو النسخ إلى 3 أنواع :
نسخ أو استنساخ القطع من الدي إن أي عن طريق الهندسة الوراثية.
إن ما يهتم به العلماء في باب الاستنساخ هو نسخ قطع من الدي إن أي كانت هذه القطع عبارة عن جين(مورث)أو جميع الجينوم(أي كل الدي إن أي الموجود في الكائن الحي).و اشهر العمليات التي تجرى هي نسخ قطعة من الدي إن أي. و يحتاج العلماء للقيام بنسخ القطع لأنهم يحتاجون إلى كمية كبيرة من هذه النسخ و ذلك لندرة استخلاصها في كل مرة من داخل الخلية و ذلك لوجود التعقيدات الإنشائية للكروموسومات .و على سبيل المثال فان الجين المنتج لسلسة بيتا في الهيموجلوبين و المعروف بمورث ببيتا جلوبين( Beta-Globin Gene) يمثل فقط 0.00005% من حجم الدي إن أي الكلي في الخلية(و الذي يتراوح ب 3بلايين قاعدة نووية).كما أن الجين العملاق و المعروف بجين الدستروفين( Dystrophin Gene ) و الذي يتراوح حجمه بال2.5 ميقابيز (2.5Megabases ) لا يمثل أكثر من 0.08% من الحجم الكلي للدي إن أي في الخلية.و لذلك فان العلماء يحتاجون إلى إجراء نسخ لهذه الجينات أو القطعة من الدي إن أي لكي يتسنى لهم التعامل بها و إجراء التجارب عليها.و هناك طريقتان رئيسيتان للنسخ:
1- النسخ عن طريق استخدام الخلايا الحية(Cell-Based DNA cloning)
2- النسخ عن طريق غير الخلايا الحية(Cell-Free DNA cloning) و ذلك باستخدام البي سي أر( Polymerase chain reaction PCR).سوف نورد لهذه الطريقة صفحة مستقلة إنشاء الله.
النسخ عن طريق استخدام الخلايا (Cell-Based DNA cloning)
يرتكز النسخ باستخدام الخلايا الحية على ثلاث خطوات:
1- تصميم قطعة مهجنة من الدي إن أي المراد نسخها و دي إن أي من ناقل (Vector) و لدية القدرة على التكاثر.و ذلك عن طريق استخدام الإنزيمات القاطعة(Restriction enzymes).
1- Construction of recombinant DNA molecules by in Vitro attachment to Replicon(Vector).
2- نقل القطعة المهجنة و التي هي بداخل الناقل إلى خلية حية و في العادة تستخدم البكتيريا(Bacteria ) خاصة النوع المعروف بالايكولي (E,coli او الخميرة( Yeast).
2-Transformation using bacteria or yeast
3- اختيار المستعمرات البكتيرية التي تحتوي على الناقل و القطعة المهجنة و السماح لها بالتكاثر.عن طريق أطباق الزراعة(Culture Plates) أو في محاليل سائلة.
3- Selective propagation of cell clones.
4-استخلاص القطع المهجنة و استخراج الدي ان أي منها بكميات كبيرة.
3- Isolation of recombinant DNA clones
1- تصميم القطع مهجنة من الدي إن يعتمد النسخ باستخدام الخلايا الحية على قدرة القطعة المراد نسخها على الانقسام أو التكاثر الذاتي عندما توضع داخل الخلية الحية.و لا شك أن قطع الدي إن أي العادية ليس لديها القدرة على التكاثر الذاتي و لذلك فان العلماء قاموا بتجاوز هذا الأمر بان ادخلوا القطعة التي يريدون نسخها في ناقل من النواقل( Vectors ) المعروفة بقدرتها على التكاثر الذاتي(راجع موضوع النواقل).و بغض النظر عن نوع الناقل فان طريقة إدخال قطعة الدي ان أي المراد نسخها إلى الناقل تقريبا واحدة.و هذه الخطوات ببساطة كما يلي:
1- بعد أن يتم تحديد القطعة المراد نسخها يضاف إليها إنزيم قاطع محدد و ليكن مثلا إنزيم ( أ )فيقوم هذا الإنزيم بقطع الدي إن أي في مكان محدد حسب التسلسل النووي.
2- يضاف نفس الإنزيم للناقل و الذي يقوم بقطعة أيضا في نفس التسلسل النووي.
3- تضاف القطع المراد نسخها بعد قطعها بالإنزيم القاطع إلى الناقل المقطّع. فتتداخل التسلسلات النووية بين الناقل و بين قطع الدي إن أي المراد نسخها. فنشاء من ذلك قطعة مهجنة من الناقل و بداخله القطعة المراد نسخها.و ترتبط قطعة الدي إن أي البلازميد من أطرافها برابطة هيدروجينية و هي رابطة ضعيفة لذلك يضاف إنزيم يسمى ليقيز أو اللاصق(Ligase ) لكي يحول الترابط بين قطعة الدي إن أي و التناقل إلى رابطة قوية(Covalent Bond )
إن أكثر لناقلات استخداما هي البلازميد و لكن يمكن استخدام الفيج أو الياك أو أي ناقل أخر.و الذي يحدد نوع الناقل المراد استخدامه هو في العادة كبر القطعة المراد استنساخها.ففي حالة القطع الصغيرة يستخدم البلازميد أو الفيج بينما يستخدم الياك أو الباك في حالة القطع الكبيرة.
2- نقل القطعة المهجنة و التي هي بداخل الناقل إلى خلية حية
في الغالب تستعمل البكتيريا خاصة النوع المعروف الايكولي(E.Coli) في عملية الزراعة و ذلك لسهولة إدخال الناقل إليها، و إلى سرعة انقسامها (تنقسم البكتريا تقريبا كل 20 دقيقة)، إضافة إلى توفر طرق الاختيار خاصة التي تعتمد على خاصة الحماية من المضادات الحيوية.و يدخل البلازميد أو الفيج تلقائيا إلى داخل البكتيريا بينما الناقلات الأخرى تحتاج إلى مساعدة ،و في العادة بتغيير تركيز الأملاح المحيطة بالبكتيريا أو تعرض إلى نبضة كهربائية لكي يسمح الجدار المحيط بالبكتيريا بدخول الناقلات.و من طبيعة البكتريا إنها تنقسم تلقائيا و بشكل سريع و كذلك البلازميدات.
3- اختيار المستعمرات البكتيرية التي تحتوي على الناقل و القطعة المهجنة
مع تكاثر الخلايا البكتيرية و تكاثر البلازميد التي بداخلها ينتج لدينا أعداد كثيرة من المستعمرات البكتيرية و بها البلازميد المهجن.و لكن قد يكون في داخل الطبق الذي زرع فيه البكتريا بعض البكتريا التي لا تحتوي على البلازميد المهجن و لكي يمكن التعرف على البكتيريا التي تحتوي على البلازميد المهجن فنه في العادة يقام باستعمال ناقلات عليها جينات واقية من المضادات الحيوية، كالجين الواقي من المضاد الحيوي امبيسيلين أو لاتترسيلين و غيرها. و بذلك فالمضاد الحيوي سوف يمنع تكاثر أي خلية بكتيرية لا تحتوي على البلازميد المهجن و الذي علي الجين الواقي من المضاد الحيوي.
4- استخلاص القطع المهجنة و استخراج الدي ان أي منها بكميات كبيرة.
بعد أن يُتعرف على المستعمرات التي تحتوي على البلازميد المهجن فانه يمكن نقلها إلى طبق جديد و يحافظ عليها و تغذى لكي تستمر بالتكاثر.و هذه البكتيريا يكون فيها أعداد كثيرة من البلازميد و بذلك تنتهي عملية النسخ.و يستفاد من هذه القطع المنسوخة في القيام بالمزيد من البحوث أو التجارب عليها كان يقام مثلا إنتاج مكتبة من الدي إن أي أو محاولة استنتاج التسلسل النووي للقطعة.كما يمكن تحوير هذه العملية بحيث يحتوي البلازميد على قطعة من سي دي إن أي(cDNA) بدل و من ثم تحوير المراحل الأخيرة من الزراعة لإنتاج بروتين بدلا من الدي إن أي. و هذه الطريقة هي التي تستعمل في إنتاج بعض الهرمونات كهرمون النمو .
تقنية PCR
Polymerase Chain Reaction
تفاعل البليمريز التتابعي
تحفظ المعلومات الوراثية و انتاج المواد لصنع الخلايا و الحفاظ عليها في داخل الحمض النووي (DNA ) . و تقوم الخلية بمضاعفة كمية الحمض النووي وقت انقسام الخلية بشكل تلقائي و بشكل سريع مع وجود نظام تصحيح للأخطاء خلال النسخ. . و تبلغ سرعة النسخ والمضاعفة إلى 1000 قاعدة نيتروجينية بالثانية ( داخل النظام الحيوي ) و هي كما ذكرنا تحدث في الخلية في وقت التكاثر والانقسام فقط .
ومع التطور في مجال التكنولوجيا الحيوية والذي يقوم على التعامل مع الحمض النووي (DNA ) بشكل أساسي ، استدعى ذلك العلماء على أن يبحثوا عن طريقة أو تقنية تقوم على مضاعفة كمية الحمض النووي (DNA ) بشكل كبير ، فكان هناك عدة محاولات لتنشيط الخلية على الانقسام المستمر بإضافة عوامل النمو growth factors ، ولكن هذه الطريقة لم تكن ذات جده لدى العلماء لأسباب كثيرة. إلى أن توصل العالم د. كري مولس Dr. Kerry Mullis في عام 1985 ( و قد حصل على جائزة نوبل في الكيمياء عام 1993)بنشر اختراعه لتقنية البي سي ار PCR فكانت هذه التقنية بوابة لكثير من التطورات المتسارعة في مجال التكنولوجيا الحيوية ، من أهم الأسباب التي ساعدت هذه التقنية على الانتشار عدم اعتمادها على النظام الحيوي(أي الخلية) و التحكم بكمية الحمض النووي (DNA ) و وسرعة في الإنتاج ولكن كان من عيوب هذه التقنية عدم وجود نظام إصلاح أخطاء الارتباط الخاطئ miss match . ما هو PCR :
هو تقنية مخبريه تم اكتشافها عام 1983م تقريباً تقوم على إكثار نسخ الحمض النووي (DNA ) خارج النظام الحيوي . أي أنها طريقة لنسخ الحمض النووي في المختبر. و لذلك فهي تقنية حيوية لاستنساخ قطعة من محددة من الحمض النووي و مضاعفة إنتاجها لكي يتسنى إجرى عليه اختبارات و فحوصات إضافية.
ما هي متطلباتPCR :
لتقوم بإنتاج الحمض النووي (DNA ) بواسطة PCR يتتطلب عليك توفير :
1. جهاز للتحكم بدرجات حرارة التفاعل بشمل دقيق و متتالي ( الدورة الحرارية Thermocycle ) : ويقوم هذا الجهاز بتغير درجة الحرارة بشكل سريع ، لآن تغير درجة الحرارة هو الأساس الذي تقوم عليه فكرة هذه التقنية . 
2. البليمريز : وهو الإنزيم الذي يقوم ببناء وترتيب القواعد النيتروجينية ( حدات الحمض النووي (DNA ) ) ، ويجب أن يكون هذا الإنزيم مقاوم للحرارة العالية ليتمكن من العمل . و قد اكتشف انزيم مقاوم للحرارة و اسم تاج Tag
3. مجموعة متفرقة من القواعد النيتروجينية: ( A T C G ) ليتمكن الإنزيم من ترتيبها في مواقعها أثناء عملية نسخ الحمض النووي (DNA ) .
4. بريمر Primer : وهو قطعة صغيرة من الحمض النووي (DNA ) ليتمكن الإنزيم من بداء البناء و النسخ عليها .
5. والشيء الأهم هو وجود نسخة من الحمض النووي (DNA ) المراد نسخه .
6. بالإضافة إلى محلول أو وسط ليتم به التفاعل : وهذا المحلول يختلف بين تفاعل و أخر .
عملية النسخ : 
بعد وضع الحمض النووي المراد نسخة مع البريمر و و إنزيم البوليمريز و مجموعة مع الأحماض النووية في أنبوب داخل جهاز التحكم الحراري فان هناك 3 مراحل منفصلة تمر بها عملية النسخ:
1. مرحلة التفكيك Denature : رفع الحرارة إلى 94 ْم وذلك لفك الحمض النووي (DNA ) الأصل .
2. مرحلة الالتصاق anneal : إنزال الحرارة إلى ما بين 55-60 ْم ليقوم البريمر بالألتزاق فيزيائياً بواسطة الروابط الهيدروجينية مع الحمض النووي (DNA ) الأصل .
3. مرحلة الامتداد extend : ثم يقوم برفع درجة الحرارة إلى 75 ْم ليقوم البلمريز بعمله في بناء الحمض النووي (DNA ) الجديد .
وهذه المراحل الثلاث تعتبر دورة كاملة وفيها يصبح الحمض النووي (DNA ) الأصل قد تضاعف ، وتعتمد كمية ناتج الحمض النووي (DNA ) على عدد الدورات ( والصورة التالية توضح العملية ) .
لمشاهدة هذه العملية اضغط على هنا.
تطبيقات PCR :
لتقنية PCR تطبيقات كثيرة في مجال أبحاث الحمض النووي (DNA ) و الوراثة ومنها :
1. الكشف عن الطفرات الوراثية : وذلك عن طريق وضع بريمر خاص للطفرة لتكثير الجين الخاص بها . ومنه نقوم بمعرفة المرض إذا كان على زوجين الكروموسومات أو على احدهما ( allele ) .
2. تعين البصمة الوراثية .
3. الكشف عن الفيروسات : وهذه الطريق هي الأدق في تحديد نوع وجنس الفيروس وكميته.
4. هو العنصر الأهم في عملية التجميع الجيني ( Recombinant الحمض النووي (DNA ) ) : حيث نقوم بتكثير الجين المراد إدخاله على البلازمد أو الحمض النووي (DNA ) المضيف .
5. استخدامه في تغير نهايات الجين لتصبح متوافقة مع إنزيمات القطع ( Restriction enzyme ) .
6. هو العملية الأساس في تحديد تتابع القواعد النيتروجينية في الحمض النووي (DNA ) ( الحمض النووي (DNA ) Sequencer ) .
7. معرفة طول الحمض النووي (DNA ) .
8. تقنية الحمض النووي (DNA ) المكمل ( cالحمض النووي (DNA ) ) .
9. تحديد الجين المطلوب من خليط من الجينات .
10. يستخدم في تقنية (microarrays ).
11. في مشروع الخارطة الجينية البشرية (human genome project ) .
12. الساوثرين بلوت (southern plot ) .
13. تقنية ارتباط الحمض النووي (DNA ) – بروتين ( الحمض النووي (DNA ) -Protein Interaction ) .
14. في مجال الطب الشرعي ( اختبار الأمومة ، حالات الاغتصاب ، تحديد الهوية ... الخ ) .
وغيرها من التطبيقات المخبرية والبحثية .
أنواع PCR : هناك نوعان من PCR :
1. PCR العادي : وهو ما تم شرحه والتطرق اليه في الخطوات السابقة .
2. rtPCR : وهو اختصار لـ ( Real Time PCR ) : وهذا النوع يقوم على نفس المبدأ ولكن الخلاف الوحيد يكون مربتط الجهاز بكمبيوتر لتحديد الوقت الحقيقي لبدا التفاعل ومن ثم الكمية الحقيقية لعدد نسخ الحمض النووي (DNA ) ويعتمد ذلك على وجود قواعد نيتروجينية حرة مشعة لتحديد ذلك . مما يسهل على الباحثين الوقت لتحدد وجود الجين المطلوب أو لا ، وكمية الجين بدون الوصول إلى نهاية الدورات الحرارية المحددة .
الاستنساخ التكاثري (Reproductive cloning ) استنساخ الكائنات الحية بالكامل يعرف الاستنساخ التكاثري أو الجنسي بأنه إنتاج لكائن حي له نفس المادة الوراثية( Nuclear DNA ) لكائن حي أخر المنسوخ منه. لقد قام الفريق العلمي بمختبر روزلين بعملية استنساخ جنسي في عملية استنساخ للنعجة دولي.و تعرف هذه العملية أيضا ًبنقل نواة الخلية الجسمية (somatic cell nuclear transfer" (SCNT ). و بشكل مبسط نقل نواة من خلية من خلايا الجسم غير الجنسية أي غير التي توجد في المبيض (في الأنثى )و من خلايا الخصية(في الذكر).و الخلية التي استعملت لاستنساخ دولي كان من خلايا الثدي لنعجة أخرى.و من ثم أخذت أيضا بويضة من المبيض و قام العلماء من التخلص من النواة التي بداخل تلك البويضة ثم قاموا بزرع النواة التي أخذوها من ثدي في داخل البويضة. ثم قاموا بصعق تلك البويضة بالكهرباء لكي ينشطوا عملية الانقسام. و بعد أن بدأت هذه البويضة في الانقسام قاموا بغرزها داخل رحم نعجة و بعدها نما الجنين في الرحم فأصبح"بإذن الله" نعجة كاملة.
علميا فان دولي (أو أي حيوان أو إنسان )يستنسخ بهذه الطريقة ليس في الحقيقة نسخة مطابقة للام أو الأب الذي اخذ منه النواة. فهناك بعض من المادة الوراثية موجود خارج النواة و هو بالتحديد موجود في داخل البويضة التي أزيل منها النواة.و هذه المادة الوراثية موجودة على جسيمات صغيرة تسمى بالميتوكوندريا (Mitochondria ). و مع أن الميتوكوندريا مصنع هام للطاقة إلا انه يكثر فيها الطفرات مع تقدم العمر وقد يكون لها علاقة بالهرم.
0 التعليقات:
إرسال تعليق